DIFERENCIACE LIDSKÝCH EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK V KARDIOMYOCYTY IN VITRO A ZLEPŠOVÁNÍ EFEKTIVITY U LINIE H9

Lidské embryonální buňky (hES) se mohou diferencovat v kardiomyocyty v in vitro podmínkách. Formují rytmicky se stahující shluky, které se poprvé objevují po 5 až 8 dnech po zahájení diferenciačního protokolu. Shluky obsahují buňky srovnatelné s jednotlivými typy srdečních buněk odpovídající asi 8. až 10. gestačnímu týdnu fetálního srdce. Dosavadní studie se potýkají s velmi nízkou výtěžností diferenciačního procesu. V naší studii jsme si kladli za cíl zlepšit efektivitu tohoto procesu.

Metody a materiál: Byly použity lidské embryonální kmenové buňky linie H9, kultivované na myších embryonálních fibroblastech, pasážované enzymaticky podle protokolu Kaufmanovy laboratoře. Diferenciace byla indukována metodou ko-kultivace s lidskými stromálními endodermálními buňkami END2 poté, co byly stromální buňky za pomoci Mitomycinu-C inaktivovány. Úvodem byly buňky pro lepší uchycení 24 hodin (den -1) kultivovány v přítomnosti fetálního bovinního séra (FBS). Následně však bylo sérum již přítomno pouze v srovnávací kultivační sadě. Kontrolní sada byla kultivována za běžných podmínek pro pasážování hES.

K modifikování efektivity kultivace byly využity: Aktivin A, Bmp 4 (Bone Morphogenic Protein) a C vitamín. Aktivin A nebyl od dne 2 přítomen v kultivačním médiu. Charakterizace diferencovaných buněk byla prováděna RNA diagnostikou. Z buněk získanou RNA jsme podrobili reversní transkripční reakci a PCR s primery Aktininu, Troponinu a NKx (charakteristický pro nediferencované km. buňky).

Výsledky: Aktivin A byl detekován u buněk s cytokiny v médiu od 8. dne, TroponinT byl detekován ve vzorku dne 18. V srovnávací skupině s přítomností FBS nebyl zjištěn ani Ativin A ani TroponinT. V kontrolní skupině byla zachována exprese NKx.

Závěr: Prokázali jsme diferenciaci hES linie H9 v kardiomyocyty. Kombinace cytokinů umožňuje zlepšit proces získávání lidských srdečních buňek.